基础研究
刘惠聪1,2 曹小芳1 万子睿1,3 安莉莎1 金孝华1 马 旭1,2*
2024, 32(6): 1231.
使用C-to-G碱基编辑器(CGBE)Td-CGBE-NG靶向敲除huh-7肝癌细胞系前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)基因,以CBE(AncBE4max)为参照,评价TdCGBE-NG对该基因的敲除效果。方法:使用引入终止密码子的策略敲除huh-7肝癌细胞系PCSK9基因。构建碱基编辑器Td-CGBE-NG和AncBE4max,构建重组质粒sg386和sg555,将Td-CGBE-NG和sg386,AncBE4max和sg555分别共转染huh-7细胞,实现c.1447C>G 和c.1953C>T 的转换,在两位点引入终止密码子S386X(TGA)和Q555X(TAG),使用sanger测序和T载体克隆验证编辑效率;实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测PCSK9基因mRNA和蛋白表达水平的变化。结果:sanger测序和T载体克隆结果显示,Td-CGBE-NG和AncBE4max的编辑效率分别为c.1447C>G 33%和c.1953C>T 25%;RT-qPCR结果显示,Td-CGBE-NG使PCSK9 mRNA的表达量降低(t=17.29, P<0.0001);Western blot结果表明,两组huh-7细胞蛋白表达量均明显下降(AncBE4max:t=5.57,P<0.01;Td-CGBE-NG:t=4.912, P<0.01)。结论:Td-CGBE-NG可以有效敲除huh-7肝癌细胞系的PCSK9基因,抑制该基因mRNA和蛋白的表达,为后续Td-CGBE-NG的应用奠定基础。