应用C-to-G碱基编辑器对PCSK9基因靶向敲除的研究

中国计划生育学杂志

基础研究

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应用C-to-G碱基编辑器对PCSK9基因靶向敲除的研究

1.国家卫生健康委科学技术研究所（北京，100081）；2.北京协和医学院研究生院；3.首都医科大学附属北京朝阳医院

Research on the targeted knockout of the PCSK9 gene by C-to-G basic group editor

1.National Research Institute for Family Planning, Beijing, 100081; 2.Graduate School of Peking Union Medical College; 3.Beijing Chaoyang Hospital, Capital Medical University

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摘要使用C-to-G碱基编辑器(CGBE)Td-CGBE-NG靶向敲除huh-7肝癌细胞系前蛋白转化酶枯草溶菌素9（PCSK9）基因，以CBE（AncBE4max）为参照，评价TdCGBE-NG对该基因的敲除效果。方法：使用引入终止密码子的策略敲除huh-7肝癌细胞系PCSK9基因。构建碱基编辑器Td-CGBE-NG和AncBE4max，构建重组质粒sg386和sg555，将Td-CGBE-NG和sg386，AncBE4max和sg555分别共转染huh-7细胞，实现c.1447C>G 和c.1953C>T 的转换，在两位点引入终止密码子S386X（TGA）和Q555X(TAG),使用sanger测序和T载体克隆验证编辑效率；实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）和蛋白免疫印迹法（Western blot）检测PCSK9基因mRNA和蛋白表达水平的变化。结果：sanger测序和T载体克隆结果显示，Td-CGBE-NG和AncBE4max的编辑效率分别为c.1447C>G 33%和c.1953C>T 25%；RT-qPCR结果显示，Td-CGBE-NG使PCSK9 mRNA的表达量降低（t=17.29, P＜0.0001）；Western blot结果表明，两组huh-7细胞蛋白表达量均明显下降（AncBE4max:t=5.57,P＜0.01；Td-CGBE-NG:t=4.912, P＜0.01）。结论：Td-CGBE-NG可以有效敲除huh-7肝癌细胞系的PCSK9基因，抑制该基因mRNA和蛋白的表达，为后续Td-CGBE-NG的应用奠定基础。

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关键词 ：前蛋白转化酶枯草溶菌素9（PCSK9）, CRISPR/Cas, 碱基编辑, huh-7肝癌细胞系

引用本文:

刘惠聪1,2 曹小芳1 万子睿1,3 安莉莎1 金孝华1 马旭1,2*. 应用C-to-G碱基编辑器对PCSK9基因靶向敲除的研究[J]. 中国计划生育学杂志, 2024, 32(6): 1231-.
LIU Huicong1,2, CAO Xiaofang1, WAN Zirui1,3, AN Lisha1, JIN Xiaohua1, MA Xu1,2. Research on the targeted knockout of the PCSK9 gene by C-to-G basic group editor. 中国计划生育学杂志, 2024, 32(6): 1231-.

链接本文:

https://www.zgjhsyx.com/CN/ 或 https://www.zgjhsyx.com/CN/Y2024/V32/I6/1231